?Sanger

Sanger發(fā)音

英：[?s??ɡ?]　　美：[?s???]

英：　　美：

Sanger中文意思翻譯

Sanger測(cè)序的原理？

Sanger測(cè)序是一種DNA測(cè)序方法，由Frederick Sanger等人發(fā)明。其原理是通過(guò)在DNA合成過(guò)程中逐漸加入一種二進(jìn)制的特殊核苷酸，使其在合成過(guò)程中隨機(jī)地被加入，并以此得到DNA序列信息。

下面是詳細(xì)的Sanger測(cè)序原理及步驟：

1. 實(shí)驗(yàn)人員首先需要將待測(cè)DNA復(fù)制許多份，即制備大量的DNA模板。

2. 對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以增大樣本中目標(biāo)序列數(shù)量。

3. 在PCR反應(yīng)中，使用特殊的、與普通核苷酸不同的dNTPs，稱為ddNTPs。ddNTPs在DNA合成中一旦被加入，便會(huì)終止合成，從而導(dǎo)致合成長(zhǎng)度的隨機(jī)截?cái)唷?/p>

4. 截?cái)喑龅腄NA片段分別按照大小進(jìn)行電泳分離。

5. 逐個(gè)讀取DNA分子，根據(jù)大小排序。使用帶標(biāo)簽的引物，利用熒光或放射性標(biāo)記物來(lái)掃描單個(gè)ddNTP引起的 DNA鏈的末端長(zhǎng)度。熒光會(huì)因dNTPs生物化學(xué)反應(yīng)而失活。

6. 以這種方式進(jìn)行的一次測(cè)序，只能獲得目標(biāo)DNA區(qū)域的一端，需要反復(fù)進(jìn)行多次測(cè)序。

7. 最后，通過(guò)多次測(cè)序結(jié)果疊加得到目標(biāo)DNA序列。

Sanger 雙脫氧法測(cè)序原理，簡(jiǎn)述測(cè)序技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

DNA鏈中的核苷酸是以3`，5`-**酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2`-脫氧核苷三**酸（dNTP），在Sanger 雙脫氧鏈終止法中被摻入了2`，3`-雙脫氧核苷三**酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí), 由于它沒(méi)有3`- OH，不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,5′-**酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過(guò)摻入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，則新生鏈的末端為T、C或G，根據(jù)這個(gè)原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。

以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則逐個(gè)將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正確的模板DNA互補(bǔ)鏈；②能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物，將其摻入寡核苷酸鏈的3 ′末端而終止新生互補(bǔ)鏈的延伸。

如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的脫氧核苷三**酸（dNTP）外，再加入一種少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。

在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機(jī)）終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。

測(cè)序現(xiàn)在是第二代技術(shù)為主，454，solexa,solid等等，以后將基于納米技術(shù)，進(jìn)行單分子測(cè)序

比如隧道探針?lè)ǖ?/p>