?molehill

molehill發(fā)音

英：[?m??lh?l]　　美：[?mo?lh?l]

英：　　美：

molehill中文意思翻譯

n. 鼴鼠丘

molehill詞形變化

名詞: molecularity | 副詞: molecularly |

molehill同義詞

molehill反義詞

molar

molehill常見例句

1 、Don't trust his words. He is a man who likes making a mountain out of molehill.───不要相信他的話，他是個愛夸大其詞的人。

2 、She's made a mountain out of a molehill.───她把一點小事夸得比天還大。

3 、A Dissertation Should "Make a Mountain out of a Molehill"───博士論文要"小題大做"

4 、It is nothing. Don't make a mountain out of a molehill.───小事情,不要小題大做。

5 、He always makes a mountain out of a molehill.───他老是大驚小怪。

6 、Make a mountain out of molehill.───小題大作。

7 、It isn't as serious as you made a mountain out of a molehill.───明明不像你說的那么嚴重,你也太夸大其辭了！

8 、Guys, as they say, when one chapter ends, a bridge appears, and then you cross that bridge and make lemonade out of a molehill.─── 各位 就像他說的 一章結(jié)束后 一座橋出現(xiàn)了 你走過那座橋 又是一番新天地

9 、Make a mountain out of a molehill: to exaggerate a minor problem.───小題大做:夸張一個小困難。

10 、make a mountain out of a molehill───v. 小題大作

11 、Never make a mountain of a molehill.───[諺]切勿小題大做。

12 、For the mistake the little kid made, the teacher made such a mountain out of a molehill as to hurt his self-respect.───對于那個小孩子所犯下的錯誤，老師是小題大做了，以至于傷害了他的自尊心。

13 、He meant to say "make a mountain out of a molehill," but he got it the wrong way round and said "make a molehill out of a mountain".───他想說“小題大做”，說擰了，說成“大題小做”。

14 、Molehills can be mountains, acorns can be oaks.─── 山丘亦山峰 橡子乃橡樹 表象不是內(nèi)在

15 、He only suffered a tiny cut. He made a real mountain out of a molehill.───他只是稍微割傷，但他卻弄得自己好像受了重傷一樣，小題大做。

16 、129.Don't make a mountain out of a molehill。───勿將鼴鼠丘看作大山；不要小題大做。

17 、Breaking out the yardstick to determine mountain from molehill can sometimes help clear your head.───有時候，拿尺子來區(qū)分大山、小丘可以幫你清晰頭腦。

18 、The giants of management education have laboured mightily to bring forth a molehill.───管理教育領(lǐng)域的巨人們竭盡全力搞出來的只是些毫無意義的東西。

19 、Stop making a mountain out of a molehill, I only made a little mistake.───不要再小題大作了，我只不過打碎了一個杯子。

20 、Killing a mosquito with a cannon/making a mountain out of molehill───高射炮打蚊子,小題大做

21 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi.───讓自由的回聲響徹密西西比州的每一座大山小丘吧!

22 、An old, close-bitten pasture, with a footpath wandering across it and a molehill here and there───這古老的牧場荒草參差，一條曲曲彎彎的小徑，一片鼴鼠拱起的土丘。

23 、She always makes a mountain out of a molehill.───停止小題大做，我只是打破了一個杯子。

24 、And I indulge you. I don't see a molehill.─── 我還縱容你 我沒有小題大做

25 、You are not hurt badly. Stop trying to make a mountain out of a molehill with crying.───你的傷并不重，不要小題大做，這么放聲大哭。

26 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring.───讓自由響自密西西比的每一座山和每一個鼴鼠丘。

27 、A man through great timidity or sloth often turns a molehill into a mountain.───一個人出極端害怕或懶惰往往會小題大做。

28 、She was only five minutes late, but he made a mountain out of a molehill about it.───她只不過遲到了五分鐘, 但他卻因此而大做文章。

29 、make a mount of a molehill───小題大做

30 、Let freedom ring from every hill and molehill of Huangtu Tableland, from every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從黃土高原的每一道山丘響起吧！在每一道山坡上，讓自由之聲響起吧！

31 、Stop trying to make a mountain out of molehill.───不要小題大作。

32 、First, the president hardly represents any moral high ground, and his absence would not move a molehill let alone a mountain.───首先，總統(tǒng)并不能代表任何道德高位，而他的缺席也并不會移動一個小小的鼴鼠丘，更不要說是一座大山了。

33 、Molehills are simply mounds of earth serving as condominiums for *all mammals.─── 鼴鼠丘只是小土堆 相當于小哺乳動物的公寓

34 、Why do you always have to make a mountain out of a molehill?───你為什么總是小題大做?

35 、It was an old, rabbit-bitten pasture, with a foot-track wandering across it and a molehill here and there───這是片古老的牧場，給兔子啃得七零八落，一條踏出的小徑橫穿其中，這里那里盡是鼴鼠拱出的小丘。

36 、Do not make a mountain out of a molehill.───不要小題大做。

37 、I'm sure she'll give you the money back, so there's no need to start making a mountain out of a molehill.───我相信她會把錢還你的,所以沒有必要小題大作。

38 、Let freedom ring from every hill and every molehill of Mississippi.From every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從科羅拉多白雪皚皚的洛磯山上響起！

39 、What I'm going to do is, uproot the palm tree, create a 3foot high molehill, and then replant it on top of it.─── 我要做的是 堆一個 三英尺高的山坡 把棕櫚樹種上去

40 、You're not hurt badly. Stop trying to make a mountain out of a molehill with crying.───你傷得并不重，不要大驚小怪地嚷嚷，小題大做了。

41 、...he was making a molehill out of a mountain.─── 他更像是把大山說成了鼴鼠丘

42 、My mountain is higher than your molehill.───我的山要比你的丘陵高。

43 、We shouldn't believe that media's words for it; they often make a mountain out of a molehill after all.───這家媒體的言論不太能夠采信，畢竟他們常常作出小題大作的報導。

44 、6、You're making a mountain out of a molehill if you think that one twinge of toothache means that you must have several teeth extracted.───如果你認為一次牙痛就意味著要撥去數(shù)顆牙的話，那你把問題看得太嚴重了。

45 、Let freedom ring from eery hill and eery molehill of Mississippi.───讓自由之聲響徹密西西比州的一座座山峰，一個個土丘！

46 、Despite my sister's years of therapy, she still has a tendency to make mountains out of molehills.─── 盡管我老妹看了多年心理醫(yī)生 她還是習慣性小題大做

47 、To make a mountain out of a molehill.───小題大做。

48 、Let freedom ring from every hill and every molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring.───這是我祖先終老的地方，這是早期移民自豪的地方，讓自由之聲，響徹每一座山崗。

49 、The situation is not as serious as the newspapers make it out to be. They're just trying to make a mountain out of a molehill.───情況并不像報紙上所說的那么嚴重。這些文章夸大其詞了。

50 、And the ultimate stumbling-block, though a mountain to India, was surely a molehill to a country of America's wealth.───這最終的障礙對于印度人來說是個大難題，可是對于美國人來說就是小菜一碟了。

51 、You're making a mountain out of a molehill.───你在小題大做。

52 、I am sure she'll give you the money back,so there's no need to start make a mountain out of a molehill.───我相信她會把錢還你的，所以沒有必要小題大做。

53 、It is only a simple job, but he makes a mountain out of a molehill.───這只是很簡單的工作，但是他卻大費周章，搞了很多事出來。

54 、"I'm sure she'll give you the money back, so there's no need to start making a mountain out of a molehill."───"我相信她會把錢還你的,所以沒有必要小題大做。"

55 、Let freedom ring from eextremeccly hill and molehill of Mississippi, from eextremeccly mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從密西西比州的每一道山丘響起吧！在每一道山坡上，讓自由之聲響起吧！

56 、If you ask your friends what they think, they will tell you that you are making a mountain out of a molehill and that you need to relax and gain perspective.───如果你詢問你的朋友的想法，，他們會告訴你，你太小題大做了，你需要放松下來去反思一下。

57 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi, from every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從密西西比州的每一道山丘響起吧!在每一道山坡上,讓自由之聲響起吧!

58 、Your “broken arm” was only a sprained wrist. Dont make amountainout of a molehill.───你只是扭了一下手腕，哪有摔斷胳膊。別小題大做了。（實習編輯：顧萍）

59 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring!───讓自由之聲響徹密西西比州的一座座山峰，一個個土丘。讓自由之聲響徹每一個山岡！

60 、Let outlook ring from every hill and every molehill of Sacred Temple.───讓光明之聲響徹圣廟，響徹云省的一座座山峰，一個個土丘!

61 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi and every mountainside.───讓自由之聲從密西西比的每一座丘陵和山坡響起來！

62 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi, from every mountainside.───讓自由之聲響徹密西西比的每個丘陵，每座角落！

63 、The expression "making a mountain out of a molehill" simply means making a big deal out of a *all deal.─── "把鼴鼠丘說成大山"這句話 意思是把小事鬧得很大

64 、Make a mountain out of a molehill; make something serious out of something trivial───虛張聲勢;夸大其辭;小題大作

65 、Make a mountain out of a molehill Calm down. There's really nothing to worry about. You're making a mountain out of a molehill.───冷靜!根本沒必要擔心。你真是大題小作。

66 、eg: Your “broken arm ”was only a sprained wrist. Don't make a mountain out of a molehill.───你只是扭了一下手腕，哪有摔斷胳膊。別小題大做了。

分子鑒定技術(shù)發(fā)展歷程？

沃森和克里克提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，“生命之謎”被打開，經(jīng)過PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)、DNA測序技術(shù)之后分子診斷正在快速成為人類疾病診斷的最有效方式之一。

發(fā)展四階段

第一階段：利用分子雜交技術(shù)進行遺傳病基因診斷：通過嬰兒胚胎期進行產(chǎn)前診斷，超早期預知某些疾病發(fā)生、發(fā)展和預后。1978年著名沒計劃以科學家簡悅威等應用液相DNA分子雜交成功進行了鐮形細胞貧血癥的基因診斷。

第二階段：以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷：PMullis發(fā)明PCR技術(shù)后迅速發(fā)展，標志著傳統(tǒng)基因診斷發(fā)展到更全面的分子診斷技術(shù)。

第三階段：以生物芯片技術(shù)為代表的高通量檢測技術(shù)：1992年美國Affymetrix制作出第一章基因芯片，標志著分子診斷進入生物芯片技術(shù)階段。生物芯片技術(shù)解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量的問題。

第四階段：以NIPT為代表的第二代測序技術(shù)：Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相與液相載體中通過邊合成邊測序的方法-焦**酸測序。目前常見的高通量第二代測序平臺主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均為通過DNA片段化構(gòu)建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應，使得第1代測序中最高基于96孔板的平行通量擴大至載體上百萬級的平行反應，完成對海量數(shù)據(jù)的高通量檢測。

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分子鑒定技術(shù)發(fā)展歷程？

分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學技術(shù)通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測DNA或RNA的結(jié)構(gòu)是否變化、量的多少及表達功能是否異常，以確定受檢者有無基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。通俗簡單的講所有基于分子生物學水平的方法學技術(shù)都屬于分子診斷技術(shù)，比如PCR技術(shù)、基因測序技術(shù)等等。

PCR技術(shù)即聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù)，基本原理類似于DNA的天然復制過程，由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：模板DNA的變性，模板DNA與引物的退火(復性)，引物的延伸。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。由1983年美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。簡單講PCR技術(shù)本質(zhì)上是針對DNA片段進行擴增放大，通過實時熒光PCR技術(shù)使得樣本中DNA含量可以檢測出來。

基因測序技術(shù)即測定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert（1977）發(fā)明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應用。簡單講基因測序技術(shù)是針對DNA片段進行測序和分析，使得DNA序列得以清晰。

下面一起來了解一下分子診斷技術(shù)近50年的發(fā)展歷程：

一、基于分子雜交的分子診斷技術(shù)

上世紀60年代至80年代是分子雜交技術(shù)發(fā)展最為迅猛的20年,由于當時尚無法對樣本中靶基因進行人為擴增,人們只能通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎(chǔ)理論、探針固定包被技術(shù)與cDNA探針人工合成的出現(xiàn),為基于分子雜交的體外診斷方法進行了最初的技術(shù)儲備。

(一)DNA印跡技術(shù)(Southern blot)

Southern[1]于1975年發(fā)明了DNA印跡技術(shù),通過限制性內(nèi)切酶將DNA片段化,再以凝膠電泳將長度不等的DNA片段進行分離,通過虹吸或電壓轉(zhuǎn)印至醋酸纖維膜上,再使膜上的DNA變性與核素標記的寡核苷酸探針進行分子雜交,經(jīng)洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時具備DNA片段酶切與分子探針雜交,保證了檢測的特異性。因此,一經(jīng)推出后便成為探針雜交領(lǐng)域最為經(jīng)典的分子檢測方法,廣為運用于各種基因突變,如缺失、**入、易位等,及與限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鑒定中。Alwine等[2]于1977年推出基于轉(zhuǎn)印雜交的Northern blot技術(shù)也同樣成為當時檢測RNA的金標準。

(二)ASO反向斑點雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印跡技術(shù)進行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性,但存在操作極為繁瑣,檢測時間長的缺點。1980年建立的樣本斑點點樣固定技術(shù)則擺脫了傳統(tǒng)DNA印跡需要通過凝膠分離技術(shù)進行樣本固定的缺點。通過在質(zhì)粒載體導入單堿基突變的方法,構(gòu)建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使對核酸序列點突變的檢測成為可能。1986年,Saiki[3]首次將PCR的高靈敏度與ASO斑點雜交的高特異性結(jié)合起來,實現(xiàn)了利用ASO探針對特定基因多態(tài)性進行分型。其后為了完成對同一樣本的多個分子標記進行高通量檢測,Saiki[4]又發(fā)明了ASO-RDB,通過將生物素標記的特異性PCR擴增產(chǎn)物與固定于膜上的探針雜交顯色,進行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上,只需通過1次雜交反應,即可篩查待檢樣本DNA的數(shù)十乃至數(shù)百種等位基因,具有操作簡單、快速的特點,一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術(shù)。

(三)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素標記的原位雜交技術(shù),1977年Rudkin[5]首次使用熒光素標記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀8090年代,細胞遺傳學和非同位素標記技術(shù)的發(fā)展將FISH推向臨床診斷的實踐應用。相比于其它僅針對核酸序列進行檢測的分子診斷技術(shù),FISH結(jié)合了探針的高度特異性與組織學**的優(yōu)勢,可檢測**完整細胞或經(jīng)分離的染色體**定的正常或異常DNA序列;由于使用高能量熒光素標記的DNA探針,可實現(xiàn)多種熒光素標記同時檢測數(shù)個靶點。

如今,FISH已在染色體核型分析,基因擴增、 基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應用。通過比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)與光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技術(shù),使其正在越來越多的臨床診斷領(lǐng)域中發(fā)揮作用。

(四)多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技術(shù)于2002年由Schouten等[6]首先報道。每個MLPA探針包括2個熒光標記的寡核苷酸片段,1個由化學合成,1個由M13噬菌體衍生法制備;每個探針都包括1段引物序列和1段特異性序列。在MLPA反應中,2個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交,再使用連接酶連接2部分探針。連接反應高度特異,只有當2個探針與靶序列完全雜交,連接酶才能將2段探針連接成1條完整的核酸單鏈;反之,如果靶序列與探針序列不完全互補,即使只有1個堿基的差別,就會導至雜交不完全,使連接反應無法進行。連接反應完成后,用1對熒光標記的通用引物擴增連接好的探針,每個探針擴增產(chǎn)物的長度都是唯一的。最后,通過毛細管電泳分離擴增產(chǎn)物,便可對把核酸序列進行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理,MLPA技術(shù)最多可在1次反應中對45個靶序列的拷貝數(shù)進行鑒定。

該技術(shù)具備探針連接反應的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經(jīng)過MRC-Holland公司10余年的發(fā)展,MLPA技術(shù)已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因?qū)W多遺傳位點鑒定、腫瘤相關(guān)基因突變譜篩查、DNA甲基化程度定量等綜合分子診斷體系,是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數(shù)變異進行檢測的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研發(fā)的光蝕刻技術(shù)制備了首個以玻片為載體的微陣列,標志著生物芯片正式成為可實際應用的分子生物學技術(shù)。時至今日,芯片技術(shù)已經(jīng)得到了長足的發(fā)展,如果按結(jié)構(gòu)對其進行分類,基本可分為基于微陣列(microarray)的雜交芯片與基于微流控(microfluidic)的反應芯片2種。

1.微陣列芯片

(1)固相芯片:微陣列基因組DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:將微陣列技術(shù)應用于MGDP檢測中已有超過十年的歷史,其技術(shù)平臺主要分為2類,即微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型雜交陣列(SNP array)。顧名思義,aCGH芯片使用待測DNA與參比DNA的雙色比對來顯示兩者間的拷貝數(shù)變異(CNV)的變化,而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片則無需與參比DNA進行比較,直接通過雜交信號強度顯示待測DNA中的SNP信息。隨著技術(shù)的不斷進步,目前市場上已出現(xiàn)可同時檢測SNP與CNV的高分辨率混合基因陣列芯片。MGDP芯片主要應用于發(fā)育遲緩、先天性異常畸形等兒童遺傳病的輔助診斷及產(chǎn)前篩查。經(jīng)驗證,使用MGDP芯片進行染色體不平衡檢測與FISH的診斷符合率可達100%[8],表達譜芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片繪制了mRNA表達譜信息。隨著表觀遺傳學在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到重視,目前也已出現(xiàn)microRNA芯片、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。類似于MGDP芯片,GEP芯片使用反轉(zhuǎn)錄后生成的cDNA文庫與固定于芯片載體上的核酸探針進行雜交,從而檢測雜交熒光信號的強度判斷基因的表達情況。相較于基因組雜交,GEP芯片對生物學意義更為重要的轉(zhuǎn)錄組信息進行檢測,對疾病的診斷與預后判斷具有特殊的意義。目前使用GEP芯片對急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病及神經(jīng)退行性變等進行診斷、分類及預后評估已經(jīng)獲得了令人滿意的效果;

(2)液相芯片:傳統(tǒng)固相芯片將檢測探針錨定于固相載體上捕獲目的序列,而Luminex公司的xMAP技術(shù)[10]則通過搭配不同比例的2種紅色熒光染料,將聚苯乙烯微球標記為不同的熒光色,并對其進行編碼得到具有上百種熒光編號的微球。通過xTAG技術(shù)將不同的特異性雜交探針交聯(lián)至編碼微球上,使得不同的探針能夠通過微球編碼得以區(qū)分。利用混合后的探針-微球復合物與待測樣本進行雜交,使微球在流動鞘液的帶動下通過紅綠雙色流式細胞儀,其中紅色激光檢測微球編碼,綠色熒光檢測經(jīng)雜交后核酸探針上熒光報告基團的信號強度,一次完成對單個樣本中多種靶序列的同時鑒定。目前,該技術(shù)已在囊性纖維化等遺傳性疾病診斷、多種呼吸道病毒鑒定及人乳頭瘤病毒分型取得了廣泛的應用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了將毛細管電泳與進樣設(shè)備整合到固相玻璃載體上構(gòu)建“微全分析系統(tǒng)”的構(gòu)想,通過分析設(shè)備的微型化與集成化,完成傳統(tǒng)分析實驗室向芯片上實驗室(lab-on-chip)的轉(zhuǎn)變。微流控芯片(microfluidic chip)由微米級流體的管道、反應器等元件構(gòu)成,與宏觀尺寸的分析裝置相比,其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和**效應在內(nèi)的特殊性能,從而在1張芯片上完成樣品進樣、預處理、分子生物學反應、檢測等系列實驗過程。

目前使用微流控芯片進行指導用藥的多基因位點平行檢測是主要臨床應用領(lǐng)域。

二、核酸序列測定

測序反應是直接獲得核酸序列信息的唯一技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構(gòu)象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設(shè)上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術(shù)上的金標準。

(一)第1代測序

1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進行DNA序列測定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學修飾降解法的模型,為核酸測序時代的來臨拉開了序幕。

Sanger等于同年提出的末端終止法(Sanger測序法)利用2'與3'不含羥基的雙脫氧核苷三**酸(ddNTP)進行測序引物延伸反應,ddNTP在DNA合成反應中不能形成**酸二酯鍵,DNA合成反應便會終止。如果分別在4個獨立的DNA合成反應體系中加入經(jīng)核素標記的特定ddNTP,則可在合成反應后對產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自顯影,根據(jù)電泳條帶確定待測分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基礎(chǔ)上,于1986年推出了首臺商業(yè)化DNA測序儀PRISM 370A,并以熒光信號接收和計算機信號分析代替了核素標記和放射自顯影檢測體系。該公司于1995年推出的首臺毛細管電泳測序儀PRISM 310更是使測序的通量大大提高。Sanger測序是最為經(jīng)典的一代測序技術(shù),仍是目前獲取核酸序列最為常用的方法。

(二)第2代測序

1.焦**酸測序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger測序法所使用的合成后測序理念,Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相[13]與液相[14]載體中通過邊合成邊測序的方法-焦**酸測序。其基本原理是利用引物鏈延伸時所釋放的焦**酸基團激發(fā)熒光,通過峰值高低判斷與其相匹配的堿基數(shù)量。由于使用了實時熒光監(jiān)測的概念,焦**酸測序?qū)崿F(xiàn)了對特**點堿基負荷比例的定量,因此在SNP位點檢測、等位基因(突變)頻率測定、細菌和病毒分型檢測方面應用廣泛。由于熒光報告原理不同,其對于序列變異的檢測靈敏度從Sanger測序的20%提高到了5%。但由于該技術(shù)的儀器采購與單次檢測成本較高,目前尚未得到大規(guī)模的臨床使用。

2.高通量第2代測序

目前常見的高通量第二代測序平臺主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均為通過DNA片段化構(gòu)建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應,使得第1代測序中最高基于96孔板的平行通量擴大至載體上百萬級的平行反應,完成對海量數(shù)據(jù)的高通量檢測。該技術(shù)可以對基因組、轉(zhuǎn)錄組等進行真正的組學檢測,在指導疾病分子靶向治療、繪制藥物基因組圖譜指導個體化用藥、感染性疾病的病原微生物宏基因組鑒定及通過母體中胎兒DNA信息進行產(chǎn)前診斷等方面已經(jīng)取得了喜人的成績。然而,由于該技術(shù)需要對DNA進行片段化處理,測序反應讀長較短(如Solexa與SOLiD系統(tǒng)單次讀長僅50bp),需要對數(shù)據(jù)進行大規(guī)模拼接,因此對分子診斷工作者掌握生物信息學知識提出了更高要求,以利于后期的測序數(shù)據(jù)分析。

(三)第3代測序

第3代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序。該技術(shù)的操作平臺目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔技術(shù)等。該技術(shù)進一步降低了成本,可對混雜的基因物質(zhì)進行單分子檢測,故對SNP、CNV的鑒定更具功效。但是目前其進入產(chǎn)品商業(yè)化,并最終投入臨床應用仍有很長的距離。

三、基于分子構(gòu)象的分子診斷技術(shù)

(一)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年間,Fischer等[15]與Orita等[16]分別提出了利用核酸序列變異所導至雙鏈變性條件差異與單鏈空間折疊差異,通過變性與非變性PAGE對變異序列進行分離鑒定的方法,即DGGE與SSCP。上述2項技術(shù)均通過變異核酸分子在空間構(gòu)象上的差異,通過特定條件下電泳速率的變化進行檢測。正因為核酸分子構(gòu)象具有序列特異性,且對于序列的改變非常敏感,常常1個堿基的變化也能得到鑒定。但由于DGGE與SSCP均必須進行PCR后開蓋電泳的操作,現(xiàn)已不常見于臨床檢測。

(二)變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用異源雙鏈變性分離變異序列、使用色譜洗脫鑒定的技術(shù),稱為dHPLC,可自動檢測單堿基置換及小片段核苷酸的**入或缺失。對于存在一定比例變異序列的核酸雙鏈混合物,其經(jīng)過變性和復性過程后,體系內(nèi)將出現(xiàn)2種雙鏈:一種為同源雙鏈,由野生正義鏈-野生反義鏈或變異正義鏈-變異反義鏈構(gòu)成的核酸雙鏈;另一種為異源雙鏈,即雙鏈中1條單鏈為野生型,而另1條為變異型。由于存在部分堿基錯配的異源雙鏈 DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同,在相同的部分變性條件下,異源雙鏈因存在錯配區(qū)而更易變性,被色譜柱保留的時間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來,從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于該技術(shù)使用了較高分析靈敏度的色譜技術(shù)進行檢測,可快速檢出<5%負荷的變異序列。但需注意的是,由于該技術(shù)主要通過異源雙鏈進行序列變異檢測,其不能明顯區(qū)分野生型與變異型的純合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用過飽和熒光染料將PCR產(chǎn)物全長進行熒光被動標記,再通過簡單的產(chǎn)物熔解分析對單個堿基變化進行鑒定。該技術(shù)的原理也是通過異源雙鏈進行序列變異鑒定。待測樣本經(jīng)PCR擴增后,若存在序列變異雜合子,則形成異源雙鏈,其熔解溫度大大下降。此時由于雙鏈被飽和染料完全填充,其產(chǎn)物熔解溫度的變化便可通過熔解曲線的差異得以判定。對于變異純合子而言,HRMA也可利用其較高的分辨率完成PCR產(chǎn)物單個位點A:T雙鍵配對與G:C三建配對熱穩(wěn)定性差異的鑒定,但是對于Ⅱ、Ⅲ類SNP的純合子變異則無法有效區(qū)分。

如何利用DNA構(gòu)象對序列進行推測,從而避免成本較高的序列測定或操作繁瑣的雜交反應一直是分子生物學研究與應用的熱點問題。目前,使用構(gòu)象變化對序列變異進行間接檢測的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成對變異序列單次閉管的擴增檢測反應。但需要注意的是,由于基于構(gòu)象變化的分子檢測手段多無法通過探針雜交或核酸序列測定對檢測的特異性進行嚴格的保證,因此其只適合大規(guī)模的初篩,而真正的確診仍需要進行雜交或測序的驗證。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子診斷檢測技術(shù),qPCR具有2項優(yōu)勢,即核酸擴增和檢測在同一個封閉體系中通過熒光信號進行,杜絕了PCR后開蓋處理所帶來擴增產(chǎn)物的污染;同時通過動態(tài)監(jiān)測熒光信號,可對低拷貝模板進行定量。正是由于上述技術(shù)優(yōu)勢,qPCR已經(jīng)成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術(shù),在各類病毒、細菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達水平監(jiān)控等多種臨床實踐中得到大量應用。但伴隨著qPCR技術(shù)的迅猛發(fā)展,有關(guān)這項技術(shù)的質(zhì)量管理問題也日益突出,如何消除各類生物學變量所引起的檢測變異,減少或抑制實驗操作與方法學中的各種干擾因素是qPCR技術(shù)面臨的難題。

(一)實時熒光定量PCR(real-time PCR)

1.雙鏈摻入法

1992年Higuchi等[20-21]通過在PCR反應液中摻入溴乙錠對每個核酸擴增熱循環(huán)后的熒光強度進行測定,提出了使用熒光強度與熱循環(huán)數(shù)所繪制的核酸擴增曲線,定量反應體系中初始模板的反應動力學(real-time PCR)模型,開創(chuàng)了通過實時閉管檢測熒光信號進行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA雙鏈,且只有嵌入雙鏈時才釋放熒光,在每1次的擴增循環(huán)后檢測反應管的熒光強度,繪制熒光強度-熱循環(huán)數(shù)的S形核酸擴增曲線,以熒光閾值與擴增曲線的交點在擴增循環(huán)數(shù)軸上的投影作為循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct),則Ct與反應體系中所含初始模板數(shù)量呈負指數(shù)關(guān)系,推斷初始模板量。隨后Morrison[22]提出了使用高靈敏度的雙鏈染料SYBR Green I進行反應體系中低拷貝模板定量的方法。這一方法操作簡便,但由于僅使用擴增引物的序列啟動核酸擴增,其產(chǎn)物特異性無法得到充分保證。雖然在實時熒光定量PCR反應后可通過熔解曲線對產(chǎn)物特異性進行檢驗,但其特異性明顯遜于使用熒光探針進行檢測,因此雙鏈摻入法并未在臨床實踐中得到認可。

2.Taqman探針

由于雙鏈摻入法存在特異性較低的問題,1996年Heid[23]綜合之前發(fā)現(xiàn)的Taq酶的5'核酸酶活性與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探針的概念提出了使用Taqman探針進行qPCR的方法。TaqMan探針的本質(zhì)是FRET寡核苷酸探針,在探針的5'端標記熒光報告基團,3'端標記熒光淬滅基團,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR過程中水解與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針,使熒光基團得以游離,釋放熒光信號。從而使能夠與靶序列雜交的探針在擴增過程中釋放熒光,通過real-time PCR的原理對其進行定量。由于其超高的特異性與成功的商品化**,Taqman探針已經(jīng)成為目前臨床使用最為廣泛的qPCR方法,其在各種病毒基因定量檢測、基因分型、腫瘤相關(guān)基因表達檢測等方面具有著不可替代的地位。

3.分子信標

同樣在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信標(moleuclar beacons)進行qPCR的方法,分子信標是5'與3'端分別標記有熒光報告基團與淬滅基團的寡核苷酸探針,其兩端具有互補的高GC序列,在qPCR反應液中呈發(fā)夾結(jié)構(gòu),熒光基團與淬滅基團發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而保持靜息狀態(tài)。當PCR反應開始后,莖環(huán)結(jié)構(gòu)在變性高溫條件下打開,釋放熒光;在退火過程中,靶序列特異性探針則與模板雜交保持線性,不能與模板雜交的探針則復性為莖環(huán)結(jié)構(gòu)而熒光淬滅,通過檢測qPCR體系中退火時的熒光信號強度,便可以real-time PCR原理特異性檢測體系中的初始模板濃度。相比于Taqman探針,分子信標使用發(fā)卡結(jié)構(gòu)使熒光基團與淬滅基團在空間上緊密結(jié)合,大大降低了檢測的熒光背景,其檢測特異性較Taqman探針更高,更適合等位基因的分型檢測。

4.雙雜交探針

1997年,Wittwer等[25]發(fā)表了使用分別標記熒光供體基團與熒光受體基團的2條相鄰寡核苷酸探針進行qPCR的方法。雙雜交探針所標記的供體基團和受體基團的激發(fā)光譜間具有一定重疊,且2條探針與靶核酸的雜交位置應相互鄰近。僅當2條探針與靶基因同時雜交時,供體與受體基因得以接近,從而通過FRET發(fā)生能量傳遞,激發(fā)熒光信號,熒光信號強度與反應體系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2條探針進行靶序列雜交,該方法的特異性比傳統(tǒng)單探針檢測體系得到了極大地提升。

(二)數(shù)字PCR

早在上世紀90年代就出現(xiàn)了使用微流控陣列對單次qPCR反應進行分散檢測的概念。基于這一理念,Vgelstein與Kinzter[26]于1999年發(fā)表了數(shù)字PCR(digital PCR)的方法,對結(jié)腸癌患者糞便中的微量 K-RAS基因突變進行了定量。相比于傳統(tǒng)的qPCR方法,數(shù)字PCR的核心是將qPCR反應進行微球乳糜液化,再將乳糜液分散至芯片的微反應孔中,保證每個反應孔中僅存在≤1個核酸模板。經(jīng)過PCR后,對每個微反應孔的熒光信號進行檢測,存在靶核酸模板的反應孔會釋放熒光信號,沒有靶模板的反應孔就沒有熒光信號,以此推算出原始溶液中待測核酸的濃度。因此,數(shù)字PCR是1種檢測反應終點熒光信號進行絕對定量的qPCR反應,而非以模板Ct值進行核酸定量的real-time PCR。

經(jīng)由Quantalife公司開發(fā)(已于2011年被BIO-RAD收購)的微滴式數(shù)字PCR是首款商品化的數(shù)字PCR檢測系統(tǒng),目前已被廣泛運用于微量病原微生物基因檢測、低負荷遺傳序列鑒定、基因拷貝數(shù)變異與單細胞基因表達檢測等多個臨床前沿領(lǐng)域。與傳統(tǒng)qPCR相比較,該技術(shù)具有超高的靈敏度與精密度,使其成為目前qPCR領(lǐng)域的新星。

五、對未來5年的展望

半個世紀以來分子診斷的高速發(fā)展離不開分子生物學技術(shù)日新月異的進步。概而言之,在過去的50年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉(zhuǎn)化與3項提升:即報告信號檢測從放射核素標記向熒光標記轉(zhuǎn)化,操作方法由手工操作向全自動化轉(zhuǎn)化,檢測分析通量從單一標志物向高通量多組學聯(lián)合判斷轉(zhuǎn)化;檢測靈敏度、精密度、特異性的快速提升。

在未來5年中,我國分子診斷事業(yè)將迎來兩方面的進步。隨著衛(wèi)生監(jiān)管部門對分子診斷重要性的認識不斷深入與越來越多高學歷、高素質(zhì)人才的進入,分子診斷將會出現(xiàn)理念的革命性進步,高通量技術(shù)將更多的進入臨床的實際應用中。隨著技術(shù)的進一步發(fā)展,傳統(tǒng)針對特定基因異常、病原微生物感染鑒定的方法學,也將在檢測的各項分析性能與操作便捷程度上取得長足的進步。對于傳統(tǒng)人力與時間成本較高的檢測方法學,將出現(xiàn)兩極分化的態(tài)勢,即Southern等經(jīng)典的檢測金標準將得到保留;而ASO-RDB等靈敏度、特異性均不能滿足實際臨床需求的方法將快速被新型技術(shù)所取代。最終,分子診斷也必將一改目前僅僅用于病原微生物基因檢測與部分遺傳性疾病診斷的局面,形成由腫瘤學、遺傳學、微生物學、藥物基因組學四足鼎立,快速發(fā)展的景象。

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